Extração de RNA de micélio de Aspergillus parasiticus

Esforços genômicos recentes em espécies de Aspergillus toxigênicas e não-toxigênicas aumentaram nossa compreensão da biologia e genética desses fungos filamentosos. No entanto, está claro que esses experimentos complexos sofrem muito com a variabilidade na qualidade do RNA entre cada réplica e é fundamental estabelecer uma plataforma para isolar o RNA de alta qualidade para uso em microarray e qRT-PCR. Nesse contexto, descrevemos aqui o isolamento de RNA de A. parasiticus durante uma mudança de carboidrato simples.

Para este experimento A. parasiticus SRRC 143 (ou SU-1; ATCC # 56775 e 201461) uma cepa de tipo selvagem usada para estudos bioquímicos e genéticos em ambas as aflatoxinas do grupo B (B1 e B2) e do grupo G (G1 e G2) escolhido. Os esporos frescos foram gerados pelo plaqueamento de 50 μL de 108 esporos em Difco Potato-Dextrose Agar (PDA) (American Scientific Products, Charlotte, NC) e incubados a 30ºC. Os esporos foram coletados de culturas de 5 dias com Triton X-100 estéril 0,05% (EMD Chemicals Inc., Gibbstown, NJ). Os esporos de A. parasiticus foram inoculados a uma concentração final de 105 esporos / mL em 200 mL de extrato de levedura (YE) meio líquido constituído por 25 g / L de extrato de levedura (DIFCO) e incubado por 48 horas a 30ºC com agitação constante a 150 rpm. Os micélios fúngicos foram colhidos por filtração in vacuo. Os micélios colhidos foram divididos em alíquotas de 1 grama. Uma amostra foi congelada em nitrogênio líquido e armazenada a – 80ºC para preparação do RNA e as alíquotas restantes foram utilizadas para inocular 100 mL do meio YES (60 g / L de sacarose e 25 g / L de extrato de levedura) e incubadas a 30ºC com 150 rpm agitando até a colheita às 3, 6, 12, 24 e 48 horas após a inoculação. As amostras de micélio fúngico colhidas foram congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a -80ºC para preparação de RNA e extração de aflatoxina.

Aproximadamente 40% das amostras produziram entre 100 e 1500 ng de DNA. Apenas 2% das amostras não produziram uma quantidade adequada de DNA. Os rendimentos máximos ficaram em torno de 16 μg. Para um PCR de rotina, 1 ng de DNA puro é usado. Uma redução adicional da quantidade de DNA é possível. A seleção da população mutante é realizada com pools de DNA. Com uma composição de pool de 8 amostras diferentes, a quantidade de DNA utilizada é reduzida para 0,125 ng / planta individual de modo que, com 100 ng de DNA, a seleção de pools de DNA com 800 sequências alvo diferentes se torna possível. A reprodução in vitro de DNA linear com GenomiPhi (GE Healthcare) permite análises adicionais de DNA com tamanhos de amostra pequenos.

O RNA total foi quantificado por meio de um espectrofotômetro ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE) e visualizado por eletroforese em gel (figura 1) para garantir a qualidade. A concentração de RNA variou de 1,5 μg / uL a 3,8 μg / uL, em um volume final de 50 μL, com uma relação de A260 / 280 variando de 2,01 a 2,19 ou melhor. Para uma rotina qRT-PCR 500 ng a 1 μg de RNA total é usado em comparação com 3 a 5 μg para o experimento de microarray típico. RNA mais do que adequado para ambos os experimentos de microarray e subsequente validação em tempo real foram isolados usando este protocolo.

Embora vários fatores ambientais possam afetar a qualidade final do RNA, que afeta diretamente os microarray e os experimentos em tempo real, demonstramos aqui uma metodologia altamente confiável capaz de isolar RNA de alta qualidade de pequenas quantidades de micélio fúngico. Este protocolo permite o processamento simultâneo de um grande número de amostras, demonstrando assim a adequação do Geno / Grinder para processamento de alto rendimento de micélio fúngico.

Figura 1.1,0% Gel de agarose. Pistas 1 e 14, escada de 1 Kb (Invitrogen). Pistas 2-5, replica AD de A. parasiticus SU-1 900 ng de RNA total isolado de Mycelium cultivado 48 horas em meio de extrato de levedura. Pista 6-9, 10-13, 15-18, 19-22 e 23-26 replica AD de A. parasiticus SU-1 RNA total isolado de Mycelium coletado em 3, 6, 12, 24 e 48 horas após o turno de Método de Extrato de Levedura para Extrato de Levedura com Sacarose.