Extração de RNA de tecido de cartilagem usando moagem criogênica

O objetivo do estudo era determinar se há uma relação entre a gravidade das doenças artríticas, especialmente da articulação do joelho, e alguns genes. Para este fim, o perfil de expressão de vários genes no tecido de probandos saudáveis ​​e doentes foi comparado. O RNA total foi isolado do tecido de cartilagem e a atividade de certos genes foi analisada por meio de PCR ou análise de microarray.

Tecido de Cartilagem Humana

Amostras de tecido de cartilagem do joelho foram coletadas de vários pacientes, bem como de probandos saudáveis, congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a -80°C. Um a dois gramas dessas amostras foram retiradas para extração de RNA e adicionadas congeladas ao recipiente de moagem. Com a opção de adaptador para vários frascos, até quatro amostras podem ser homogeneizadas simultaneamente no Freezer / Mill®. Utilizando a função de pré-resfriamento do Freezer / Moinho, as amostras foram mantidas a cerca de -196°C por mais dois minutos. Isso garantiu resfriamento suficiente e, portanto, fragilidade ideal.

Por razões técnicas – devido à grande área de superfície e ao pequeno tamanho de partícula, o pó de cartilagem mostrou uma tendência a descongelar rapidamente, o que deve ser absolutamente evitado (degradação de RNA) – o reagente fenol-clorofórmio (peqGoldRNAPure ™, peqLAB; Erlangen, Alemanha ) usado para preparação posterior já tinha sido adicionado às amostras (aprox. 2 a 2,5 ml). Depois de adicionar o reagente, os frascos de trituração foram colocados na posição vertical em nitrogênio líquido até que o tampão solidificou. Em seguida, as amostras de cartilagem e o impactador foram adicionados ao frasco resfriado. Para garantir que o impactador não congele no reagente, o Freezer / Moinho foi acionado brevemente para verificar o movimento, ouvindo o som do moinho. A moagem foi realizada em três ciclos de dois minutos cada, com freqüência máxima. Entre os ciclos de moagem, as amostras foram resfriadas por dois minutos para atingir a fragilidade ideal novamente. Assim, todo o procedimento demorou 12 minutos. O pó resultante foi transferido para tubos Falcon e carregado com mais reagente peqGOLD (aprox. 20 ml).

O RNA foi subsequentemente purificado usando um método de extração com fenol-clorofórmio de acordo com o protocolo do produtor. A fim de garantir uma limpeza e qualidade ótimas do RNA, a fase líquida resultante foi aplicada nas colunas midi RNeasy. Após o exame fotométrico do RNA, as amostras foram analisadas por PCR quantitativo após transcrição reversa ou alternativamente com o sistema AffymetrixGeneChip®. Os frascos de moagem foram limpos em várias etapas. Primeiro foram limpos mecanicamente com lenço de papel e álcool 70%, depois com espuma de sabão. Após enxágue com água, foram novamente enxaguados com álcool 70%. Este processo de limpeza deve ser realizado sempre prontamente, pois o reagente fenol de descongelamento corrói os frascos (os acessórios de aço inoxidável não são afetados). Antes da próxima utilização, todo o conjunto de moagem foi autoclavado.